Untersuchungsmethogen in der Gentechnik

Restriktasen und Ligasen

Bei allen wichtigen Verfahren der Gentechnik werden Erbmoleküle entweder getrennt oder zusammengefügt. Da auf molekularer Ebene aber keine mechanischen Werkzeuge funktionieren, nutzen die Genetiker hier bakterielle Enzyme. Restriktionsenzyme (Restriktasen) zerschneiden und Ligasen verbinden DNA-Moleküle.

Gelelektrophorese

Bei der Gelelektrophorese werden in die Vertiefungen eines Gels (z. B. Agarose-Gel) DNA-Fragmente eingefüllt. Diese wandern nach Anlegen einer elektrischen Spannung zur Anode. Die größeren DNA-Stränge wandern langsamer als die kleineren. So erhält man Bandenmuster, die unter analytischen Gesichtspunkten verglichen werden können (DNA-Fingerprinting). Die DNA einzelner Banden kann für weitere Untersuchungen entnommen werden.

Hybridisierung

Wenn doppelsträngige DNA auf über 90 °C erhitzt wird, denaturiert das Molekül. Es zerfällt in Einzelstränge. Anschließendes Abkühlen führt zur Renaturierung. Die Stränge verbinden sich wieder. Das Zusammenlagern von unterschiedlichen Nucleinsäuresträngen, die aber z. T. komplementäre Basensequenzen besitzen, wird als Hybridisierung bezeichnet. Dabei können sich DNA- oder RNA-Moleküle miteinander verbinden.
Je mehr Basenpaare in den hybridisierten Doppelsträngen komplementär sind, umso mehr Wasserstoffbrückenbindungen werden zwischen den Stickstoffbasen ausgebildet, die wiederum das Hybrid stabilisieren.
Bekannte zur Hybridisierung eingesetzte Sequenzen werden als Sonden oder Marker bezeichnet. Sie sind in der Regel mit einem Fluoreszensfarbstoff oder radioaktiv markiert.

Die Hybridisierungstechnik kann zur Beantwortung einer Reihe von Fragestellungen dienen:

1. Durch Untersuchung der Renaturierungsgeschwindigkeit kann erforscht werden, wie hoch der Anteil von sich wiederholenden DNA-Sequenzen im Genom ist (Escherichia coli 0,3 %, Mensch 35 %).
2. Die Lage und Länge des codierenden Bereichs (Exons) eukaryotischer DNA kann durch mRNA-Hybridisierung aufgeklärt werden.
3. Mithilfe von Sonden lassen sich das Vorkommen und die Lage spezifischer Sequenzen auf unterschiedlichen Chromosomen oder in verschiedenen Bakterienstämmen ermitteln.
4. Durch die Blotting-Technik können mithilfe von Sonden gelelektrophoretisch aufgetrennte DNA-Fragmente lokalisiert und identifiziert werden.
   Die Blotting-Technik wurde 1975 von E. M. SOUTHERN entwickelt.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die Entwicklung der Polymerase-Kettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction, PCR) im Jahr 1983 durch KARY B. MULLIS war ein bedeutender Schritt in der gentechnischen Forschung. Diese Methode ermöglichte es, DNA schnell und relativ einfach zu vervielfältigen. Das Verfahren ist mit der identischen Replikation vergleichbar.
Als Ausgangsstoffe werden die DNA-Probe, die vier Stickstoffbasen in Form von DNA-Nucleotiden (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) und Primer (20-30 Nucleotide lange Startersequenzen) benötigt. Eine hitzestabile DNA-Polymerase der Bakterienart Thermus aquaticus, aus heißen Quellen des Yellowstone National Parks in den USA, katalysiert die Kettenreaktion.
Bestimmte DNA-Abschnitte können selektiv vermehrt werden, wenn die ausgewählten Primer komplementär zu den Anfängen des betreffenden DNA-Fragments sind.

Der dargestellte einzelne Zyklus der PCR (Bild 6), er dauert in der Regel wenige Minuten, wird 30- bis 40-mal in einem Automaten durchlaufen. Die DNA-Menge vermehrt sich um den Faktor 230-240. Eine noch stärkere Vervielfältigung ist nicht sinnvoll, da auftretende Replikationsfehler sich dann anhäufen. Noch größere DNA-Mengen können nur durch die aufwendigere Technik der Klonierung gewonnen werden.

DNA-Sequenzierung

Die Entwicklung von Routineverfahren zur DNA-Sequenzierung war einer der größten Fortschritte der genetischen Forschung in den 70er-Jahren des letzten Jahrhunderts. WALTER GILBERT (geb. 1932) und A. MAXAM entwickelten 1977 die Dimethylsulfat/Hydrazin-Methode . FREDERICK SANGER (geb. 1918) und A. COULSON entwickelten ihre Methode 1975. Jetzt war es möglich, mit relativ geringem Aufwand die DNA zu lesen. Heute sind die Verfahren weitestgehend automatisiert. Am weitesten verbreitet ist die Kettenabbruch- bzw. Didesoxymethode nach F. SANGER und A. COULSON.
Voraussetzung für das Kettenabbruchverfahren sind einsträngige DNA-Fragmente. Der Ablauf der Sequenzierung ähnelt der Polymerase-Kettenreaktion. Die Einzelstränge dienen der DNA-Polymerase als Matrize zur Synthese eines komplementären zweiten Strangs. Neben den „normalen“, Ketten verlängernden Nucleotiden enthält die Reaktionsmischung aber auch modifizierte Nucleotide, an denen sich kein neues Nucleotid anheften kann.
Bei Bindung dieser veränderten Nucleotide bricht die Kettenreaktion ab. Mit gleicher Wahrscheinlichkeit erfolgt der Kettenabbruch an jedem Nucleotid. Für jedes Didesoxynucleotid gibt es eine eigene Reaktionsmischung. Die entstandenen Fragmente werden im Anschluss gelelektrophoretisch, nucleotidgenau getrennt. Das entstandene Bandenmuster entspricht der DNA-Sequenz.